| 货号 | 150043 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 简介 | 对微量或者珍贵样本进行高度均一的全基因组扩增 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 描述 | Performance 从多种样本中得到高产量DNA，可用于多种应用 REPLI-g Mini Kit可用于多种样本，包括基因组DNA、新鲜或干血、新鲜或冰冻组织、细胞。50 μl反应体系的常规DNA产量可以达10 μg（参见"Consistent DNA yields using any sample type"）。不同的模板质量均可扩增得到同样的DNA产量（参见"Uniform DNA yield from various amounts of template"）。从不同的模板浓度获得一致的DNA产量十分要，对于高通量应用而言尤其如此，在下游的基因分析中不需要纯化或定量。 产物平均长度大于10 kb，在2 kb到100 kb之间，因此能够用于复杂的限制性酶切和长片段PCR等下游应用。REPLI-g扩增的DNA十分适用于基因分型，如使用TagMan引物/探针对的SNP基因分型（参见"Reliable SNP genotyping "），测序和STR/微卫星分析（参见"Accurate genotyping"）。 成功应用于二代测序 许多文献已展示了REPLI-g技术扩增的DNA在二代测序中的成功应用，包括肿瘤细胞的外显子组测序、全基因组测序、宏基因组学的研究、以及单细胞分析。对于将全基因组扩增DNA用于二代测序一直有一些争论，因此我们检测了可能影响全基因组扩增DNA在下游应用中表现的影响因素。我们发现：起始材料的质量对二代测序实验有很大影响。如果使用的是低质量DNA（如降解的DNA），或长时间保存的组织材料，用扩增获得的DNA进行二代测序则无法获得可靠结果。但是，对完整细胞或未降解的纯化后DNA使用REPLI-g技术进行全基因组扩增，然后用于二代测序，结果可与纯化的基因组DNA的测序结果相媲美。分析测序结果的各基因组位点和错配率得出结论，全基因组扩增后垃圾DNA水平低，扩增获得的DNA和纯化获得的DNA的错配率基本相同（参见"Comparable NGS (next-generation sequencing) results obtained using purified gDNA or REPLI-g amplified DNA"）。 高度可靠的全基因组扩增 REPLI-g技术提供高度均一的全基因组扩增。Phi29聚合酶可复制长达70 kb的DNA，而不会从DNA模板上脱离（参见"Schematic representation of REPLI-g amplification"）。与基于PCR的全基因组扩增技术不同，Phi29聚合酶具有3→5外切酶校对活性，在复制过程中的高保真性是TaqDNA聚合酶的1000倍。试剂盒中提供的抗外切酶的引物可确保DNA的高产量，优化的全基因组扩增缓冲液体系适用于长片段DNA，对各位点进行均一的扩增。 REPLI-g技术的性能优于基于PCR的全基因组扩增技术 传统方法扩增基因组DNA需要进行耗时的EBV转化细胞系步骤，并用随机或变性的寡聚核苷酸引物进行全基因组扩增。基于PCR的方法（如：DOP-PCR和PEP）会产生非特异性的扩增产物，不能完全覆盖所有位点。有时，产生小于1 kb的DNA，在许多下游应用中都无法使用。由于使用低保真酶Taq DNA聚合酶，产物DNA突变率较高，扩增易出错，会导致碱基对突变。REPLI-g技术没有这些缺陷，并能够高度均一的扩增全基因组，位点偏差小、错配率小（参见"Highly representative amplification using REPLI-g technology" and "Consistent and accurate whole genome amplification"）。 Principle 独特的REPLI-g技术使用创新的高保真酶Phi29聚合酶，利用多重置换扩增（MDA）技术扩增复杂的基因组DNA，并结合温和的碱变性，均一的扩增基因组位点。REPLI-g Mini Kit的常规产量为10 µg，如需更多产量，可使用REPLI-g Midi Kit；因为这两个试剂盒的实验方案相同，反应体积也相同。反应体系构建十分简便，仅需约15分钟的手动操作时间，因此REPLI-g技术使用简便、可靠，适用于对少量或珍贵的样本进行完全、均一的扩增。 扩增原理 REPLI-g利用等温基因组扩增，即多重置换扩增（MDA）技术：随机引物与变性DNA结合，在等温环境中，在Phi29聚合酶的作用下，进行置换合成反应。每个置换的单链作为模板，与引物结合，扩增生成高产量的DNA（参见"Schematic representation of REPLI-g amplification"）。Phi 29聚合酶为噬菌体衍生酶，具有3→5外切酶活性，准确性为Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi29聚合酶与独特的REPLI-g缓冲液体系相配合，能够轻松的打开DNA的二级结构，如发卡结构，所以可确保在扩增过程中，聚合酶正常发挥作用。因此该技术生成的DNA片段长度可达100 kb，没有序列偏差（参见"Unbiased amplification with Phi29 polymerase"）。 DNA的碱变性 在酶扩增前，必须使基因组DNA变性，这通常是通过高温孵育、或在强碱性条件下进行的。REPLI-g Midi Kit采用温和的碱性环境孵育，使DNA变性，而片段化程度低，突变少。由此扩增获得的DNA十分完整，扩增的片段长，覆盖所有基因组位点和序列。使用REPLI-g Midi Kit能够获得可靠的结果，确保在下游应用中不出现假阳性或假阴性结果。采用热变性的WGA技术会损伤模板DNA，导致扩增结果不准确（参见"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation"）。 Procedure 便利的单管操作 REPLI-g Midi Kit通过简便、高效的方法从纯化的少量基因组DNA样本或直接从全血、干血卡、白膜层、组织、培养的细胞中进行准确的全基因组扩增（参见"REPLI-g Mini and Midi procedure"）。加入裂解缓冲液使样本DNA裂解并变性，之后进行短暂孵育（参见"REPLI-g Mini and Midi procedure"）。中和后加入预混液（包括REPLI-g Mini DNA Polymerase），在30°C过夜进行等温扩增。REPLI-g扩增获得的DNA刻在–20°C长期储存（参见"Consistent long-term stability"）。 选择适合您实验需求的REPLI-g Kit（参见下表）。 表1. 种类丰富的REPLI-g Kits
Applications REPLI-g扩增得到的DNA可用于多种下游应用，包括：
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| 说明书 |
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| 供应商 | Qiagen |