探针法定量real-time PCR分析甲基化状态

Performance

EpiTect MethyLight PCR Kit可灵敏检测DNA甲基化状态的微小变化（参见"Sensitive real-time PCR quantification"），需与双标分析配合使用，如预设计的EpiTect MethyLight Assays。

Principle

EpiTect MethyLight PCR Kits与EpiTect MethyLight Assays或其他双标探针-引物配合使用，可灵敏定量亚硫酸氢盐转化后DNA中的甲基化DNA。根据对于序列甲基化状态区分程度的要求，MethyLight可用于定量和半定量分析。

双标记探针，包括TaqMan探针，是序列特异性的寡聚核苷酸，带有荧光基团和淬灭基团。荧光基团在探针的5末端，而淬灭基团通常在3末端或中间。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶的5→3外切酶活性水解探针，将荧光基团和淬灭基团分离。可检测的荧光量与扩增的PCR产物成正比。

特异性甲基化探针定量MethyLight real-time PCR产物

使用MethyLight PCR进行定量甲基化分析，含有不同荧光标签的两个双标探针与一组PCR引物配合使用。亚硫酸氢盐转化后DNA需要一个不同的探针，以区分甲基化和非甲基化CpG位点。这些引物特异性针对非甲基化位点。一个探针在某一位点与甲基化DNA特异性结合，而其他探针特异性结合同一位点的非甲基化DNA。不同的探针包含不同的荧光基团，由此定量甲基化和非甲基化序列（参见"Quantitative MethyLight real-time PCR"）。

特异性甲基化探针半定量MethyLight real-time PCR产物

对于半定量MethyLight分析，一个双标探针与一组特异性结合某些甲基化位点的PCR引物配合使用。亚硫酸氢盐转化后DNA需要一个不同的探针，以区分甲基化和非甲基化CpG位点，这些引物要特异性结合甲基化的亚硫酸氢盐转化后DNA。如果甲基化特异性引物结合到DNA上，它会在延伸阶段加长，并且Taq DNA Ploymerase的5→3外切酶活性会引起引物降解，释放荧光基团。由于荧光基团与淬灭基团已经隔离，可检测到荧光（参见"Semiquantitative MethyLight real-time PCR"）。

提高特异性

EpiTect MethyLight Master Mix专用于序列特异性探针法高灵敏地检测甲基化和非甲基化DNA。除各种盐类和添加剂，缓冲液含有经优化的KCl和(NH4)₂SO₄组合，提高每个PCR扩增退火过程特异性引物与探针结合的比例。可确保区别探针杂交和检测非甲基化和/或甲基化靶序列。严谨的引物退火条件可在亚硫酸氢盐转化后DNA扩增过程中提高PCR特异性，能够可靠的进行基于探针的甲基化状态检测。

MethyLight PCR的对照反应

为确保用于检测甲基化或非甲基化DNA的MethyLight PCR探针和引物具有特异性，需要进行对照反应。应用不同浓度的亚硫酸氢盐转化后对照DNA（完全甲基化和完全非甲基化）。此外，确定甲基化程度过程中可将这些对照DNA混合物作为定量分析标准。配合EpiTect Control DNA Set，QIAGEN以即用型试剂盒的形式提供所有的对照DNA，包括：甲基化的亚硫酸氢盐转化后DNA、非甲基化的亚硫酸氢盐转化后DNA和人类基因组DNA，用于可靠的、标准化的甲基化特异性对照反应。

Procedure

EpiTect MethyLight PCR Kit以预混液的形式提供，确保快速方便的反应体系构建。提供两种试剂盒，即预混液中添加ROX和未添加ROX，针对各种不同的real-time循环仪可灵活选择。经验证的操作流程适用于大部分real-time循环仪，确保最佳效果。

EpiTect MethyLight PCR Kit提供含有ROX参比染料的预混液，专为配合需要高浓度ROX染料进行荧光校准的real-time PCR仪进行了优化（如Applied Biosystems的仪器，除了Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems）。

EpiTect MethyLight PCR + ROX Vial Kit提供不含ROX染料的预混液，但提供单独包装的ROX染料，可根据real-time循环仪的要求加入反应体系。该试剂盒用于需要较低浓度ROX染料进行荧光校准的循环仪（如Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems），可选择性地使用需ROX染料的循环仪（如Stratagene的仪器），以及无需ROX染料的仪器。

表观遗传学中标准化的工作流程

生物学和医药研究的很多领域中，尤其是肿瘤学、干细胞研究和发育生物学研究中，获得表观遗传学信息是首要任务。但是，由于缺乏提供可重复性数据的标准化方法，尤其是样本材料的限制，分析DNA的甲基化变化非常困难。QIAGEN最新推出的EpiTect方案，建立了从DNA样本收集、稳定和纯化到亚硫酸氢盐转化和real-time或终点式PCR甲基化分析或测序的标准化预分析和分析方案（参见"Standardized workflows in epigenetics"）。

Applications

EpiTect MethyLight PCR Kits适用于定量和半定量real-time PCR分析，可与EpiTect MethyLight Assays或其他双标探针-引物配合使用。